對于內徑比較小的柱子，樣品大小應該減少至與柱子直徑的平方成正比。如果樣品中包含可電離的分子，樣品量＞1μg就會出現(xiàn)柱子超載的現(xiàn)象。

     樣品進樣量對HPLC分離效果影響基于以下原因：

• 為了避免由于樣品進樣量太大，而在分離中出現(xiàn)不想要的變化；

• 為了增加痕量分析中檢測器的敏感度需要使用盡可能大的樣品進樣量；

• 為了在制備HPLC中大化回收凈化后的產品量。

  
  

     由于樣品的進樣體積或進樣量太大而造成的分離度和（或）保留時間的變化，分別稱為體積超載和質量超載。

     體積超載：樣品體積對分離效果的影響。

     假設樣品中的分子濃度保持不變，樣品體積對峰的尺寸和形狀的影響如下圖所示，隨著樣品的進樣體積按照進樣順序1~4不斷增加，色譜峰開始逐漸加寬，然后形成一個平扁的頂部。

    幾種不同的色譜柱構造，它們的最大樣品進樣體積如下：

(150mmx4.6mm，3μm顆粒）Vs≤80μL

(100mmx4.6mm，3μm顆粒）Vs≤50μL

(30mmx4.6mm，3μm顆粒）Vs≤30μL

(30mmx2.1mm，1.5μm顆粒）Vs≤4μL。

     如果色譜圖中較早洗脫出來的峰的分離度并不是關鍵，那么就可以進樣較大體積的樣品。

     樣品可能溶解在某種溶劑的溶液中而不是在流動相里。當樣品溶劑比流動相要弱時，可以進樣體積較大的樣品而不會對峰寬和分離度造成負面影響。相反，進樣溶解在比流動相強的溶劑里的樣品，往往會使得色譜圖中較早洗脫出來的色譜峰發(fā)生譜帶加寬和（或）扭曲變形。用比流動相強的溶劑來配備樣品是一種常見的錯誤， 如果有可能應該盡量避免。如果不方便更換樣品溶劑，那么雖然樣品溶解在較強的溶劑里， 但是只要進樣體積夠小，色譜圖就不會受到影響（可以忍受）。

     以1:1的比例用較弱的A溶劑（比如水）稀釋樣品，然后以2倍的體積進樣。這樣做能有效地減少樣品溶劑帶來的問題（尤其是當一個樣品溶劑＞50%B) ，而同時也能保持進樣的樣品量不變。較大的進樣體積和較強的樣品溶劑可以在梯度洗脫法里使用，因為在梯度洗脫開始的時候樣品會和較弱的流動相（較低的％B ）混合。如果有疑問，那么將進樣體積減小為原來的一半以及增加為原來的2 倍，并且觀察不同的進樣體積對分離度的影響，接著再根據(jù)相應的情況作進一步調整。

      質量超載：樣品重量對分離效果的影響。

     即便樣品的進樣體積較小，溶解樣品的質量也會有可能導致色譜柱超載，造成樣品峰的加寬和變形。這種情況的發(fā)生是因為柱子保留樣品分子的容量是有限的；也就是說靠近峰帶的固定相中樣品飽和。下圖顯示的是一個由于柱子超載而造成的譜帶加寬的例子。樣品進樣量的大小順序為1a<1b<1c<1d<2<3<4（最大進樣量）。

     只要樣品中各個成分的重量不要過多（ 通常對于4.6mm內徑的柱子進樣量<50μg ，內徑小的柱子，進樣量也相應要減少），每個峰帶在柱子內的移動就不會受到樣品中其他峰帶的影響。因此，樣品中單個化合物的重量，往往決定了色譜柱是否會超載，峰形是否會發(fā)生改變，而與樣品總重量無關。其中一個化合物引起色譜柱的超載，也不會影響到樣品中其他色譜峰的分離（只要它們都是基線分離的）。只有當單個化合物的進樣量太大，才會發(fā)生色譜柱超載的現(xiàn)象并同時出現(xiàn)色譜峰的拖尾（ 比如對于內徑為4.6mm 的柱子進樣量＞50μg)。

01

02

03